House M.D. handelt von einem Ärzteteam, das an einem Krankenhaus eine spezielle Diagnose-Einheit bildet und dabei Woche für Woche medizinische Rätsel lösen muss. Woche für Woche muss das Team die richtige Diagnose finden, um den jeweiligen Patienten – oft in einem Kampf gegen die Zeit – zu retten. Leiter der Diagnosespezialisten ist Dr. Gregory House (Hugh Laurie), der einen Stock als Gehhilfe benötigt, seit ein Muskelinfarkt in seinem rechten Oberschenkel zu spät erkannt wurde. House ist als Arzt ein Genie. Seine Art, mit Patienten umzugehen, ist hingegen reichlich unorthodox und gewöhnungsbedürftig: "Menschlichkeit wird überbewertet" ist einer der ersten Sätze, die wir von ihm hören. Am liebsten würde er nur von seinem Büro aus praktizieren, ohne jemals tatsächlich einen Patienten zu Gesicht zu bekommen. Der eigenwillige und unkonventionelle Doktor hat eine Gruppe junger Fachleute um sich herum versammelt, jeder ein Spezialist auf seinem Gebiet: Der Neurologe Dr. Eric Foreman (Omar Epps), die Immunologin Dr. Allison Cameron (Lisa Edelstein), der Intensivmediziner Dr. Robert Chase (Jesse Spencer) und Onkologe Dr. James Wilson (Robert Sean Leonard), der als einziger so etwas wie ein Freund von House ist. Gegenspielerin von House ist die medizinische und administrative Leiterin des Krankenhauses Dr. Lisa Cuddy (Lisa Edelstein), die ihn fortwährend an seine Pflichten in der Klinik erinnert und stets bemüht, ihn ein wenig von seinem Lebensmotto abzubringen: "Everybody lies."